纯化方法工艺总结

1PHA提取纯化工艺总结

一、破壁之前的预处理

溶剂与方法：

化学试剂预处理

目的：降低细胞壁强度从而减少操作压力或通道数。

（Harrison等研究表明PH和温度是影响细胞破碎的主要因素，分子量的降解与温度和时间有关，与PH无关。短时间碱性PH休克可显著弱化细胞壁强度而不会损伤多聚物，提高预处理的碱性可增加高压均质前后蛋白质和DNA的释放。）

高压均质：高压均质机也称“高压流体纳米匀质机”，它可以使悬浮液状态的物料在超高压（最高可达60000psi）作用下，高速流过具有特殊内部结构的容腔（高压均质腔），使物料发生物理、化学、结构性质等一系列变化，最终达到均质的效果。

均质：均质也称匀浆，是使悬浮液(或乳化液)体系中的分散物微粒化、均匀化的处理过程，这种处理同时起降低分散物尺度和提高分散物分布均匀性的作用。

碱性PH休克：

⑴碱性PH10.5休克预处理革兰氏阴性菌然后高压均质，能使可溶蛋白释放提高37.5%。

⑵使用阴离子表面活性剂处理（1%SDS，70摄氏度，20分钟）后经高压电均质只需要34.5MPa的压力，单通道即能释放出全部的DNA，显著降低了均质的操作压力和通道数。

⑶单价阳离子钠离子和钾离子能增强细菌的热损伤，发酵液里加入8kg/m3(0.137mol/L)的NaCL在60摄氏度保温60分钟可导致20%可溶蛋白释放，随后单通道64.8MPa高压均质可使94%的可溶蛋白和66%的DNA释放，对照组为67%和28%。⑷加入EDTA和溶菌酶。

优点：快速易控，均质破碎效果更理想。

二、破坏细胞壁

1、高压均质法缺点：需要高能量和足够的冷却能力以防止产物过热和细胞颗粒微化

2、SDS（PH=10，菌体干重浓度为10g/L）

（原理：表面活性剂分子能插入到细胞膜的双层脂质体中，表面活性剂浓度越大，插入到细胞膜中的分子越多，膜体积也被撑得越来越大，达到饱和后，再加入活性剂，就会导致细胞膜破裂，胞内物释放，活性剂和磷脂形成微团，PHA颗粒被包裹在肽聚糖中；此外，SDS能使蛋白质变性也有助于细胞破裂）

3、另一表面活性剂TritonX-100

溶解蛋白质

4、高速珠研磨缺点：需要高能量和足够的冷却能力以防止产物过热和细胞颗粒微化

三，纯化和除杂

1、取冷菌体，蒸发干燥后，加入10倍菌体体积的热丙酮溶剂混合20min洗涤一次

2、次氯酸钠溶液PH9.8，菌体干重浓度11g/L，作用时间1H，在次氯酸钠处理前冷干菌体能提高phb的分子量

3、对弥散液30度8000r/min离心10分钟，分成三组，最适作用条件为30%次氯酸盐浓度，反应90分钟，氯仿与次氯酸钠溶液体积比1：1。弥散法中次氯酸钠有破碎细胞，消解非phb细胞物质，降低有机相粘度，控制分子量，及漂白脱色作用。

4、Sds预处理后用再用次氯酸钠消化10min，用表面活性剂预处理能去除85%的总蛋白

5、0.1mol氨水在40-50度下作用30分钟，可去除10%的非phb杂质。

6、在1molnaoh，ph=12作用40min，同样可去除70%左右的蛋白质。

四，提取PHA

1、氯仿法：蒸发干燥后，再加入10倍菌体体积的氯仿，90度提取4小时，提取完毕静置冷却，过滤除

去非PHA物质，吸取上清液（即氯仿相）得澄清PHA溶液，加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4度搅拌静置，过滤压干，60度干燥24小时。

另：丙酮预处理后，加入50倍菌体体积的氯仿，抽提48小时，在除去非PHA物质后，以5倍氯仿体积的溶液（甲醇：水7：3）沉淀出PHA

2、次氯酸盐法：次氯酸钠初始值Ph13.4含量5.4%，以HCL调节ph。最适条件是次氯酸钠ph9.8，菌体干重浓度11g/L，时间1小时

3、氯仿和次氯酸盐法：氯仿和次氯酸盐弥散液

4、乙酸乙酯法：用己烷或庚烷将phb从乙酸乙酯中沉淀出来

5、异戊醇法：高温下大量溶解PHA，低温下析出PHA，发酵后加热去油，絮凝5g/lcacl2，16。1g/lna2pho4*12h2o以及0。05g/l聚丙烯酰胺

6、有机溶剂法：加入乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸戊酯、乙酸甲，乙，丙酯中的一种或几种的混合溶剂；其中湿菌体与脂类有机溶剂的重量/体积1：1-5，干菌体与脂类有机溶剂重量/体积1：3-5；混匀，在80-120度下加热1-4小时提取PHA；分离除去菌体残渣，保留有机相；用3-15倍体积于有机相的乙醇、正己烷或丙醇沉淀出PHA；分离，以无水乙醇洗涤沉淀，45-55度下真空加热3-5小时（优选在50度下真空加热4h)，干燥后得到PHA。当直接用湿菌体提取PHA时，可先将湿菌体与无水乙醇或丙醇混合均匀，再加入提取溶剂进行提取；或在搅拌条件下进行，100-200r/min，优选150r/min。5，次氯酸氯仿法材料：冷藏的干燥菌体，（基因工程菌）E。coliHMS174(PTZ101)，PHA含量60%，次氯酸钠（工业纯），稀硫酸，氯仿（分析纯），丙酮分析纯。

实验条件：

次氯酸钠溶液体积浓度分别为15%20%30%40%，次氯酸钠溶液与氯仿的体积比1：1，作用时间15，30，60，90，120min，温度30°

试验方法：

菌体破壁提取PHA取2g干燥菌体加入装有50ml次氯酸钠与氯仿混合溶液摇瓶中，将摇瓶在30°摇床中175r/min振动一定时间后离心4000r/min，用吸管吸取底层含pha的粘稠液，并在蒸馏烧瓶中蒸馏出氯仿，所得PHA在60度干燥后称重。

2 蛋白质纯化方法总结

分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。

1、前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态(如果做不到呢？比如蛋白以包涵体形式存在)，不丢失生物活性。为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点(为什么呢)的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。

动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。

粗分级分离：当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。

2、细分级分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。

蛋白质分离纯化的方法：

一、根据分子大小不同的纯化方法

1、透析和超过滤；

2、密度梯度离心；

3、凝胶过滤。

二、利用溶解度差别的纯化方法

1、等电点沉淀和pH控制；

2、蛋白质的盐析和盐溶；

3、有机溶剂分级分离法；

4、温度对蛋白质浓度的影响。

三、根据电荷不同的纯化方法

1、电泳；

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳；

3、毛细管电泳；

4、等电聚焦；

5、层析聚焦；

6、离子交换层析。

四、利用选择性吸附的纯化方法

1、羟磷石灰层析；

2、疏水作用层析；

五、利用配体的特异生物学亲和力的纯化方法

亲和层析(affinitychromatography)：

a、凝集素亲和层析；

b、免疫亲和层析；

c、金属螯合层析；

d、染料配体层析；

e、共价层析。

六、高效液相层析合快速蛋白质液相层析

分子生物学常用试剂的配制1.LB(Luria-Bertani)培养液、平板的配制配制每升LB培养液，应在950ml去离子水中加入：细菌培养用酵母提取物(bacto-yeastextract)5g细菌培养用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/LNaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，151bf/in2(1。034105Pa)高压下蒸汽灭菌20min。

3菠萝蛋白酶纯化方法总结

（1）沉淀法

沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。

（2）离子交换色谱法

离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有SephacrylS-200柱、MonoS阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。用DEAE-52离子交换柱层析结合SephadexG-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。

（3）固定化金属离子亲和色谱法

固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。HualiNie等（20XX）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化15.4倍，回收率达94.6%，而且不会造成任何变性。固定化金属亲和层析技术正逐渐被采用，PawanGupta等（20XX）将菠萝蛋白酶成功固定在亚氨基二乙酸载体琼脂糖凝胶6B型中。Cu2+与亚氨基二乙酸（IDA）的络合被用来作为螯合配体将单个组氨酸结合到菠萝酶上。固定化高亲和性载体的制备是试图将可溶性交联菠萝蛋白酶制剂固定到铜-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶上。

（4）超滤法

超滤法是在离心力或较高的压力作用下，选择适当孔径的超滤膜，使水和其他小分子物质通过，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超滤法提取酶蛋白，具有无相变、生物活性不易丧失、得率较高，不会改变溶液糖酸比等特点。用超滤法浓缩有机溶剂提取的菠萝蛋白酶产品质量好，对环境污染少，可以实现清洁生产，酶粉得率比高岭土工艺高出47%。超滤法分离提取的粗酶比活力较单宁沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超滤法浓缩提取菠萝蛋白酶需要对操作条件进行研究，尽最大可能提高超滤效果，促进工业化生产。杨辉等研究认为压力差在300kPa，透过液通量为50L/m2·h时即能保持较大的流量，又不会对酶活造成损失。在对菠萝汁进行超滤的过程中，料液透过通量随压力差增加和循环速度的增大逐渐上升并趋于稳定。用超滤法浓缩提取生物大分子时因不同膜材料的透过通量和截留率不同，而导致不同的分离特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜浓缩工艺较适合对菠萝蛋白酶进行超滤浓缩，可使果菠萝酶回收率达93.3%，截留率达97.8%。用PSA膜超滤菠萝皮汁制得的菠萝蛋白酶酶活总回收率为65.7%。李兴，林哲甫用二氧化钛吸附菠萝果汁中的菠萝蛋白酶再用截留值2万和5万的超滤膜超滤浓缩，能获得较高比活的果酶。得到的果酶活力回收率为54%，比活力为911单位/mg。目前将纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥法结合的综合性技术已达到国际先进水平，创新性较好。

(5)双水相萃取法

利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化并浓缩蛋白质。该方法的优点是比较温和可在室温下进行，一般不造成酶的变性失活，还可提高其稳定性。与其它分离纯化方法相比，利用双水相萃取法有很多优点，如易于放大、成本低、可以连续操作、并且是环境友好的。这就使其成为分离纯化生物分子的诱人的替代方法，在国外进行了大量的应用。B.RavindraBabu等（20XX）首次使用该法从菠萝中分离纯化菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，结果使菠萝蛋白酶的纯度提高4.0倍，得到约228%的活性回收率。双水相萃取法提供了一种有效的、经济上可行的分离纯化菠萝蛋白酶的方法。在双水相体系中用PEO–PPO–PEO嵌段共聚物分离纯化菠萝蛋白酶，其活性回收范围为7.5%~79.5%，纯化倍数0.1~1.25倍。在双水相体系中，各种参数如聚合物的分子质量、聚合物和形成相的盐浓度和分离体系的pH对分离纯化的结果影响较大。

(6)反胶团萃取法

生物技术的发展为重要生物分子的生产开辟了一条新的途径，在选择性提取的生物分子中，逆胶束有机相很有潜力发展为液液萃取的生物分离技术。反胶团是表面活性剂，使水滴稳定分散在有机溶剂中，这种表面活性剂是双亲性的有机复合物，既亲脂也亲水。反胶团萃取法有如下一些优点：不会造成原有功能或活性的损失、界面张力较低、易于规模化、有连续运作的潜力。H.UmeshHebbar等（20XX）用溴化十六烷基三甲铵/异辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸钠/异辛烷的反胶束体系从菠萝废料的水提物中提取和初步纯化菠萝蛋白酶。用反向阳离子表面活性剂（CTAB）胶束体系能使菠萝蛋白酶获得一个较好的活性回收率可达106%，纯化5.2倍，而采用阴离子表面活性剂（AOT）则没有获得较好的产率。

(7)新型纳米吸附剂法

随着一种以氧化铁纳米粒子为核心，聚丙烯酸为离子交换组的新型磁性纳米吸附剂的开发，其在生物分离和生物医学领域已经被广泛应用。它具有高的离子交换容量和快速的吸附/解吸率。这种纳米粒子用于菠萝蛋白酶的分离是很有效的。近年来，纳米纤维膜由于其非常大的表面积和体积比、优越的机械性能引起人们的广泛关注，HaitaoZhang等（20XX）通过一步静电纺丝技术以二甲基乙酰胺为溶剂制备出超细聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜，用化学的方法连接到壳聚糖的表面，共价连接到染料配体辛巴蓝上制成染料固定化亲和膜，而且可以重复使用，膜的再生显示出良好的机械性和化学稳定性。这种新开发的染料亲和膜首次用于菠萝蛋白酶的吸附，批次试验揭示出它具有一个很高的吸附菠萝蛋白酶的能力，可以实现高效率的大规模的吸附，这种低非特异性结合的亲和膜对于纯化高纯度的菠萝蛋白酶是很有效的。

供试酶液的制备（纳米二氧化钛吸附法分离纯化效果明显好于高岭土吸附法和超滤浓缩有机溶剂提取法，所得酶的比活力分别是后两者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠萝茎在4℃冷室中预冷12h，组织捣碎机捣碎，加1倍0.05mol/L，pH6.0磷酸缓冲液（含5mmol/L的EDTA）浸提，缓慢搅拌，浸提10min，4层纱布过滤，离（4000rpm，15min），上清液即为供试酶液，蛋白质含量为1.62mg/mL。（菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上）操作要点：选取干净的菠萝茎，除杂，清水中漂洗三次，沥干，放入4℃冷室中预冷备用。预冷后茎用高速组织捣碎机打浆，加0.05mol/L，pH6.0磷酸缓冲液浸提10min，4层纱布过滤，滤液在4000rpm条件下，离心15min，取上清液，放入4℃冷室中备用。

1、纳米TiO2吸附法

（纳米TiO2的用量直接影响吸附效果。用量不足，对酶的吸附不完全；用量过多，增加处理和洗脱难度，浪费资源）（超滤过程中会发生浓差极化现象，导致菠萝蛋白酶的损失。在压力较低时，随压力增大，通量呈直线上升，但随压力增大，膜逐渐被压实，浓差极化（膜分离过程中的一种现象，会降低透水率，是一个可逆过程。是指在超滤过程中，浓差极化由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。）现象增加，膜通量增幅变缓。）

供试酶液中加纳米TiO2搅拌均匀→离心（4000rpm，15min）→取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱→搅拌（30min）→离心（4000rpm，15min）→取上清液→超滤浓缩→冷冻干燥→酶制品。操作要点：

①吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米TiO2搅拌均匀，吸20~30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。

②超滤：洗脱液先用截留分子量为40KD的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为20KD的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。

③冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。

④纳米TiO2吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用0.1mol/LNaOH溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复90%以上。

通过正交试验得影响实验效果的因素主次为：纳米TiO2用量＞吸附液pH＞吸附时间＞吸附温度2高岭土吸附法（高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率及纯化倍数都较低，投资较大。）

供试酶液→加4%高岭土，搅20min，10℃吸附30~60min→静置→吸出上清→沉淀用16%NaOH调pH6.5~7.0→加7%~9%NaCl，搅30min→压滤，滤液用1:3（体积比）盐酸调pH5.0→搅拌→加滤液量25%（NH4）2SO4→溶解→4℃静置过夜→离心→沉淀→干燥（王平诸等，20XX）。

操作要点：

①吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入4%的高岭土，搅拌约20min，在10℃吸附30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高岭土吸附物。

②洗脱：用16%的NaOH溶液调节吸附物的pH至7.0左右，再加入吸附质量为7%~9%的工业食盐，搅拌30min进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。

③盐析：将压滤液收集在盐析槽中，用1:3的盐酸调节pH至5.0左右，搅拌加入压滤液质量25%的硫酸铵，待完全溶解后，4℃过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗酶。

3、超滤浓缩有机溶剂沉淀提取

供试酶液→超滤浓缩→有机溶剂沉淀→干燥→酶制品。

操作要点：

①超滤：供试酶液先用截留分子量为40KD的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为20KD的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质。

②有机溶剂沉淀：将浓缩液降温至0~4℃，边搅拌边加入-20℃的95%乙醇，直至混合液中乙醇浓度为50%，静置，使酶沉淀，移出上清液，即为湿酶。

③干燥：将湿酶在0℃下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。